人類基因體與新生兒照護The Human Genome and Neonatal Care

導論 Introduction

• DNA 雙螺旋結構發現後不到 50 年，人類基因體計畫（Human Genome Project）就完成重大里程碑：辨識出人類單倍體基因體約 30 億個核苷酸的幾乎完整序列。
• 自那些單一共識基因體發表以來，定序技術進步，已能報告超過 100,000 個完整基因體，並在數百萬人身上描述數百萬個基因變異。
• NICU 臨床醫師正與遺傳專家合作，累積專業並運用變異套組（variant panels）與 NGS 等工具，診斷在嬰兒期顯現的出生缺陷與其他全身性疾病的病因。
• 本章回顧新生兒照護者需要的基因體概念，兩大主軸為：
  1. 臨床上診斷新生兒遺傳疾病的方法，以及不斷演進、以基因體為核心的工具。
  2. 相對常見的基因變異與早產相關複雜疾病之間的關聯研究摘要。
• 常用名詞見 Table 25.1。

人類基因體計畫與基因體醫學全貌 The Human Genome Project and the Big Picture of Genomic Medicine

國際合作與全球現況 International Efforts

• 人類基因體計畫是國際合作，重點之一是找出正常與致病基因變異在染色體上的位置。
• 這項努力仍在延續：部分國家以族群為基礎，對數萬人做全基因體或全外顯子體定序。但多集中於資源相對充足的國家，歐洲血統族群的比例偏高。
• 全球基因體醫學合作組織（Global Genomic Medicine Collaborative, G2MC）成立於 2015 年，目的是促進基因體醫學在全球落實，改善個人與族群健康，並強調必須納入地理與族群多樣性。
• 更多全球性的基因體資訊世代收案已經展開。G2MC 把醫療人員教育計畫列為優先，因為這很可能是基因檢測能否被適當分配與使用的限速步驟。
• 透過合作，臨床醫師與研究者已針對第 2 型糖尿病、乳癌患者，或身高、出生體重等特徵，發表涵蓋數千人的基因變異全面研究。
• 這些國際合作奠定了人類基因體計畫最大的成就之一：與人類 DNA 序列及其變異相關的資訊，由公眾信託持有，並透過數十個資料庫與分析平台開放給科學界使用。

線上資源 Online Resources

OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）

• 臨床醫師的主要入口之一，以疾病為單位，同時收錄基因發現的臨床與科學描述。
• 每日更新的完整目錄：超過 16,000 個已描述的基因，其中超過 7000 個基因的表型關聯已知分子基礎，超過 4500 個基因帶有造成表型的突變。
• 線上版是人類基因與遺傳表型的彙編，還連結到其他線上資源，可查詢：
  • 基因變異及其與疾病的關聯。
  • 基因在物種間的共通性，以及不同血統族群的變異盛行率差異。
  • 蛋白質與蛋白質結構的變異。
  • 基因所屬的生物路徑。

CSER 與 ClinVar

• 臨床定序探索研究聯盟（Clinical Sequencing Exploratory Research, CSER）：由 NHGRI 與 NCI 資助，以跨領域方式探討定序的分析效度、臨床效度與臨床效用，以及倫理、法律與社會影響。
• ClinVar：OMIM 內有連結，是免費、公開的資料庫，收錄人類變異與表型關係的報告及其佐證。

基因體與基因體學 The Genome and Genomics

基因體的組成 Exons, Introns, and the Definition of a Gene

• 人類基因體計畫提供的關鍵資訊：量化鹼基對總數（約 30 億）、定義基因，並讓我們更了解基因體 DNA 可如何分類。
• 真核生物的基因體 DNA 包含：
  • 外顯子（exons）：「被表現」、轉譯成蛋白質的 DNA 區域。
  • 內含子（introns）：夾在中間、不轉譯成蛋白質的區域。
• 外顯子雖然重要，卻只占全基因體 DNA 的不到 2%。
• 外顯子以外的區域，對基因何時、如何表現的關鍵角色，愈來愈受到重視。
• 「基因」的定義不斷改變。隨著我們更了解遠端調控元件、DNA 修飾、染色質結構、基因間交互作用、外顯子跳躍（exon skipping）、轉譯後修飾等因素，「基因做什麼」的理解也在更新。

非編碼序列與基因調控 Noncoding Sequences and Gene Control

• 保守的「非編碼」序列如何影響人類健康與疾病，仍是重要的研究領域。
• 早在完整定序之前，就已知外顯子附近有調控區，有時稱為啟動子區（promoter regions）：轉錄因子可結合於此，「開啟」或「關閉」基因表現。
• 調控區通常與實際的轉錄起始位（transcription start site）是不同的鹼基對；mRNA 的轉錄從起始位開始。
• 某些 mRNA 組合形成終止密碼子（stop codons），標示序列中轉錄終止之處（原文說法）。

基因體的來源：外來 DNA Origins of the Genome

• 基因體將近一半源自外來 DNA，以轉位元件（transposable element）DNA 的形式經生殖細胞進入基因體；轉位元件最早由 Barbara McClintock 在玉米中描述。
• 內含子鹼基序列中約 8% 是人類內源性反轉錄病毒（human endogenous retroviruses, HERVs）的產物：病毒把自身 RNA 遺傳物質的 DNA 拷貝，在漫長歲月中插入人類基因體。
• 愈來愈多證據提示 HERV 在多種疾病中可能具有功能性角色，包括神經退化性疾病、自體免疫疾病與多種癌症。

選擇性剪接 Alternative Splicing

• 基因體 DNA 能產生的 RNA 與蛋白質，遠多於過去的想像。
• 已知蛋白質編碼基因約 20,000 個。選擇性剪接（alternative splicing）讓同一基因以不同外顯子組成 mRNA，編碼不同蛋白質，使蛋白質數量的估計值從 20,000 提高到遠超過 100,000。
• 這在發育中的神經系統特別重要：超過 90% 的多外顯子基因在整個發育過程中都有選擇性剪接。

粒線體 DNA Mitochondrial Deoxyribonucleic Acid

• 粒線體是細胞內處理能量的胞器。每個粒線體都有自己的基因體，與核基因體不同，一般認為源自細菌 DNA 的併入。
• 粒線體基因體長約 16,500 個鹼基對，編碼 37 個基因。
• 粒線體序列變異與多種疾病有關。
• 純母系遺傳（maternal-only inheritance）：粒線體位於細胞質，精子中沒有，因此母親會傳給所有子女，再由女兒把母親的粒線體 DNA 傳給下一代。
• 已知粒線體 DNA 變異可致病，加上分子與細胞操作技術進步，促成了胚胎粒線體移植（embryonic mitochondrial transplantation）：把「健康」粒線體移植到帶有致死性粒線體變異的早期胚胎細胞質中。

人類基因體的變異 Variations in the Human Genome

• 基因變異（genetic variations）是個體之間 DNA 序列與結構的差異。
• 類型包括：單核苷酸多型性（SNPs）、拷貝數變異（CNV）、插入與缺失（indels）、多型性重複序列（polymorphic repeats）與微衛星變異（microsatellite variants）。
• 此外還有染色體物質數量的差異，稱為非整倍體（aneuploidies）。

單核苷酸多型性 Single Nucleotide Polymorphisms

• SNP 是最早被普遍描述的人類基因變異來源。
• 定義：基因體上特定的核苷酸位置，染色體該處可能有 2 種（甚至 3 或 4 種）不同核苷酸。
• 舉例：某位置可能是 T 或 G，而族群間有差異，例如某族群 40% 的人在該基因座為 T、60% 為 G。
• 數量：任兩人之間，30 億個鹼基對中最多有 1% 不同，因此全基因體有數百萬個 SNP。
• 族群分布：多數變異見於所有人類族群，但有些變異似乎高度限於特定族群或血統。
• 偵測：晶片式 DNA 序列偵測可同時檢測單一個體超過 1 million 個 SNP，費用約 $100。
• 資料庫：自 1999 年起，公開線上資源 dbSNP（Single Nucleotide Polymorphism database）已收錄超過 500 million 個 SNP。
• 致病性：絕大多數 SNP 看來不致病，但可能緊鄰確實增加疾病傾向的 DNA 變化。
• 連鎖不平衡（linkage disequilibrium）：一個 SNP 的基因型與鄰近 SNP 的基因型高度相關，因此可用這個現象偵測到附近的致病變化。

拷貝數變異 Copy Number Variants

• CNV 是另一種可造成遺傳疾病的基因變異。小型與大型缺失、重複事件雖然自 1970 年代就已知，但其在疾病中的廣泛角色直到近期才被認識。
• 大小：從數個核苷酸到數千個鹼基對，因此兩名健康者的基因體鹼基對總數可相差數百萬。
• 形成機制：
  1. 這些變異可含一個或多個基因，在特定染色體位置以串聯方式存在 2、3 或更多拷貝。
  2. 減數分裂時，這些大致相同的串聯序列彼此對齊，偶爾會錯位。
  3. 錯位造成一個或多個拷貝的缺失或重複，使拷貝數的範圍從 0 到許多。
  4. 若被複製或缺失的片段含有功能性基因，基因產物的量就可能高於或低於參考水準。

與 CNV 相關的疾病

• Di George 症候群 22q 缺失。
• 與脊髓性肌肉萎縮症（spinal muscular atrophy, SMA）及 Charcot-Marie-Tooth 病相關的缺失。
• 與 Prader-Willi、Angelman 症候群相關的 15q11–q13。
• 微缺失症候群現可用陣列式 DNA 分析精確描述。
• 除了 22q、15q11–q13 這類表型可辨識的症候群，還有造成先天異常、發展遲緩或兩者兼具的罕見缺失或重複事件；若雙親染色體結構正常，可推論其病因角色。
• 微缺失／重複事件也可能解釋自閉症等疾病為何有時呈散發、有時呈家族性。

臨床檢測與判讀難處

• 估計 CNV 造成所有已知變異相關疾病的約 10%。
• 染色體微陣列（chromosomal microarray, CMA）已成為偵測 CNV 最常用的臨床檢測。
• CNV 雖重要，仍有技術與臨床問題待解決：健康人也常見 CNV；若病人某基因體區域有 CNV，但相關基因與其表現沒有明確連結，是否致病就難以確定。

個體的變異數量 Variant Counts in Individuals

人類基因體圖譜完成後，已辨識的變異數量爆增。2015 年發表的 1000 Genomes project 結果如下：

• 多數已辨識變異看來與疾病無關：它們既未被預測為截斷蛋白質或改變胜肽序列的變異，也未與已知啟動子區或其他功能性基因體區域重疊。

連結基因與疾病 Linking Genes and Diseases

歷史起點：先天性代謝異常 From Garrod to the Double Helix

• 人類基因體定序完成的 101 年前，Archibald Garrod 注意到黑尿症（alkaptonuria）在表親聯姻所生子女中盛行率高，推測它可能是依孟德爾定律遺傳的代謝疾病。這是人類第一個歸因於後來所稱「遺傳學」的疾病。
• 他也指出，尿液變黑的化學基礎可能是人類生物多樣性的表徵：有些無害，但其他特徵可能以致死疾病呈現。
• 他創造了先天性代謝異常（inborn errors of metabolism）一詞，描述由化學路徑錯誤與變異造成的疾病。
• 此後一百多年間，DNA 及其對人類發育與疾病的影響陸續被揭示，包括雙螺旋結構讓轉錄與轉譯得以進行。
• 現已明確：23 對人類染色體（原文為 23 human chromosomes）上的估計基因數約 20,000 個；DNA 鹼基對中只有 2%–3% 是編碼蛋白質的序列（外顯子），絕大多數被視為「內含子」。正常與異常發育都由這些基本材料而來。

疾病負擔 Burden of Disease in Newborns and Children

• 估計 5%–10% 的新生兒有疑似致病的染色體疾病。
• 數十年來，美國 20% 的嬰兒死亡（NICU 嬰兒死亡中比例更高）歸因於染色體與先天異常。
• 基因定序結合強大資訊工具的應用擴大，使基因變異相關疾病的盛行率持續上升。
• 除死亡風險之外，存活超過出生頭幾天的複雜先天異常與染色體疾病嬰兒，在兒科病房與加護病房的住院人數中占比遠高於其人口比例。
• 相較於沒有這些問題的孩子，受影響兒童住院更頻繁、住院更長、費用更高。
• 期望隨著更多變異與疾病連結，能依據對病理生理與併發症易感性的更深入認識提供照護，引導預防與治療策略，進而改善預後。

後人類基因體時代的診斷 Making a Diagnosis in the Post Human Genome Era

為何要找病因、何時定序 Why and When to Test

• 對疑似遺傳疾病的嬰兒，知道病因可以引導後續照護，包括治療，以及預防相關或可預期的問題。
• 人類基因體計畫完成後，定序更普及、成本下降，也帶來新問題：廣泛定序相對於核型、染色體微陣列等較熟悉的檢測，應在什麼時機進行？
• 這個問題會持續被檢視並改變；要定序整個基因體只需 $20 的時代，可能已不到十年。

基因檢測工具 Genetic Testing Tools

最常用的工具用於評估個體基因體的數量、結構與序列（Table 25.3）。

傳統逐步作法

• 傳統上由核型分析（karyotype）開始，提供染色體數量與結構資訊，有時再針對臨床醫師認為與該表型最相關的「嫌疑基因」區域做非常標靶的定序。
• 第一線檢測包括核型，以及／或用於非整倍體或其他染色體異常的 FISH；這些異常包括染色體重排與染色體物質的大片段增減。

目前常見作法：核型加 CMA

• 臨床醫師常同時開立核型與 CMA。CMA 能辨識特定變異、CNV，以及解析度更高的基因物質增減，如插入與缺失（indels）。
• CMA 用於評估多重異常嬰兒，也用於驗證疑似的非整倍體。
• CMA 已演進為含寡核苷酸與單核苷酸探針，可同時辨識單核苷酸變異與 CNV，對微重複、微缺失症候群有高敏感度與特異度。
• 如今 CMA 可找出最多 20% 先前已與疾病表型相關的潛在致病變異。
• WES 與 WGS 的費用與時間快速下降，這種逐步作法正在轉型；但下降幅度還不足以讓核型、微陣列、特定基因與變異套組失去用處。

檢測策略的演變

1. 傳統先做核型，或加做 FISH；再依表型做非常標靶的基因定序，逐步推進。
2. 約 10 年前WES、WGS 受費用與報告時間限制，只用於其他檢測都無法解釋表型的個案。
3. 目前常同時開立核型與 CMA；CMA 用於多重異常嬰兒並驗證疑似非整倍體。
4. 轉型中WES 與 WGS 的費用與時間快速下降，統合分析主張考慮以 WGS／WES 作為第一線檢測；但核型、微陣列與特定套組仍有其用處。

次世代定序的臨床應用 Clinical Application of Next-Generation Sequencing

WES 與 WGS 現已用於臨床。約 10 年前因費用與報告時間的限制，只有在懷疑遺傳病因、但核型、FISH 或含 CNV 分析的 CMA 都無法解釋表型時才使用。

里程碑病例：XIAP 缺乏症

這是最早以廣泛外顯子體定序找到特定致病變異、進而改變治療的病例報告之一，清楚展現 NGS 能縮短診斷時間並實質改變照護方向。

1. 15 個月大男童因生長遲滯（failure to thrive）與肛周膿瘍就診。
2. 其後數月依推定的 Crohn 病治療；瘻管持續，接受結腸造口。
3. 數年間接受多種藥物方案（包括 cyclophosphamide）；同時做了廣泛免疫功能檢測、已知缺陷的特定基因檢測，以及專家建議的 CNV 評估，全部陰性。
4. 決定定序病程複雜、多項檢測仍無診斷、預後差，團隊改用當時相對新的不預設立場（agnostic）方法：用 5 micrograms 病人 DNA，定序約 180,000 個蛋白質編碼外顯子與 700 個 miRNA 外顯子。
5. 定序結果辨識出 16,124 個變異。進一步分析找到 X 連鎖細胞凋亡抑制基因（X-linked inhibitor of apoptosis gene, XIAP）的新穎半合子錯義突變：高度保守位置的 G 變為 A，造成半胱胺酸變為酪胺酸。
6. 驗證超過 2000 個人類對照序列及其他物種的同源基因，都未在此位置發現該變異，這是找出潛在致病變異的關鍵分析步驟。功能檢測顯示與疾病表型相符的病理變化；母親證實為帶因者。
7. 治療為預防致命的噬血性淋巴組織細胞增生症（hemophagocytic lymphohistiocytosis），依 XIAP 缺乏症的建議治療，接受異體造血前驅細胞移植。
8. 移植後 6 週孩子可以吃喝，腸胃疾病未復發。

NGS 的分析流程與判讀

1. 定序：可用特定基因套組、整個基因體（WGS），或選擇性定序構成基因體絕大多數基因的外顯子（WES）。方法仰賴快速演進的定序技術，以及對快速累積之基因型與表型連結資料的先進自動分析。
2. 電腦分析（in silico analysis）：與參考人類基因體比對，找出變異。
3. 預測與頻率：用工具預測序列改變後的蛋白質結構與功能，並評估該變異在不同血統族群的頻率。
4. 分級：結合上述資訊與已知致病基因的資料，以標準命名、5 級量表標記變異：致病（pathogenic）、可能致病（likely pathogenic）、意義未明（VUS）、可能良性（likely benign）或良性（benign）。
5. 專家審查：通常再由該疾病表型的專家與遺傳流行病學家審視，確認變異在該名嬰兒的分級。

分級一致性：ClinGen 與 ClinVar

• 分析軟體有多種，不同報告實驗室對變異的分級可能不同。
• ClinGen（Clinical Genome Resource）由 NHGRI 資助，致力於讓基因—疾病、變異—疾病關係的最新分級更一致；已發展工具，評估基因—疾病關聯的臨床效度與變異的致病性，供臨床照護使用。
• ClinGen 的成果透過 ClinVar 公開。ClinVar 是 NCBI 的資料庫，彙整研究者、臨床定序實驗室、專家團體、診所與病人登錄系統提供的基因體變異及其健康關係資訊。
• 單一研究者也可提交疑似與特定疾病相關的變異；ClinVar 的提交依下列項目評分：
  • 提交相同資料的來源數量與類型。
  • 工作小組與專家委員會的驗證；他們會審視遺傳流行病學證據，以及實驗模型系統的支持證據。
• 這些判讀與使用介面隨新資料持續演進。ClinGen 網站列出超過 20 個工作小組、超過 30 個變異判讀委員會，並有教育模組與公開瀏覽工具。
• 資料持續累積，受 ClinGen 計畫訓練的專家委員會也在增加，目標是減少基因／變異／疾病關聯判讀的差異。

定序的限制

• 檢測陰性不代表沒有致病變異，可能是因為：
  • 檢測的技術限制。
  • 受影響基因與疾病的關係尚未被描述。
• 部分疾病可能無法診斷，例如：
  • 表觀遺傳改變造成的疾病：Prader–Willi、Beckwith–Wiedemann 症候群。
  • 重複序列疾病：先天性肌強直症（congenital myotonic dystrophy）。

診斷率證據：世代研究與統合分析

儘管有這些限制，對疑似但未確診遺傳疾病的嬰幼兒，較深入的定序似乎比過去的逐步作法更常、更快得到診斷。

• 上海 3 家三級中心，307 名嬰兒：以 WES 或序列套組，在超過 40% 病人找到致病的遺傳病因；在 180 天追蹤期內死亡的嬰兒中，超過 60% 找到遺傳病因。
• 該世代中，有皮膚（integument）、複雜免疫相關問題、代謝與神經系統表現的嬰兒，帶有已知致病基因變異的機會較高，顯示篩選定序對象的標準很重要。

下一步是以快速（數天而非數週）周轉時間的完整 WES 或 WGS，把表型與序列變異連結起來。

• 統合分析（37 篇研究，2011–2017 年發表，超過 20,000 名兒童）：比較 WES、WGS 與 CMA 的診斷率，結論是 WGS／WES 應考慮作為第一線基因檢測，因其診斷與臨床效用都優於 CMA（診斷率 <20%）。
• WGS（41%）與 WES（36%）的診斷效用相近。
• 有雙親檢體可做「三人組（trio）」分析，以及在醫院內判讀，都能提升診斷效用。
• NICU 族群的初期研究：接受快速 WGS 者，診斷比例 42%–57%；因診斷而改變臨床處置 30%–72%；預後改變 24%–34%。

NSIGHT1 隨機對照試驗（NCT02225522）

• 全名與資助：NIH 資助的 Newborn Sequencing In Genomic medicine and public HealTh。
• 目標：原計畫收納 1000 名病因不明、小於 4 個月的重症嬰兒，判定快速（26 小時）全基因體定序（rapid WGS, rWGS）是否比標準基因檢測，更能提高 28 天內得到基因診斷的比例。
• 判讀：依美國醫學遺傳學會（American College of Medical Genetics）指引的致病與可能致病分類。
• 標準檢測：新生兒篩檢（兩組都納入分析）、染色體檢查（核型、FISH）、CMA、甲基化與 CNV 檢測、代謝檢測，以及非加速的標靶基因分型或定序。
• 技術限制：本試驗使用的次世代定序方法無法偵測 CNV 與結構變異。
• 提前終止：僅收 65 名嬰兒（64 名在 NICU）即終止。原因是研究期間非加速 WGS 已成為標準診斷檢測，約 80% 對照組嬰兒接受定序作為標準檢測，另有 5 名對照組嬰兒「恩慈交叉」（compassionate cross-over）接受 rWGS。

• 標準檢測做出的 15 個診斷中，5 個（33%）rWGS 無法偵測：拷貝數或結構變異（n = 4）、DNA 甲基化改變（n = 1）。
• 試驗計畫規定，rWGS 基因分型結果須以另一方法確認後才能臨床報告，但即將發生危及生命之惡化者除外。
• 致病或可能致病變異中，超過一半是新生（de novo）而非遺傳而來。
• 21 名確診嬰兒中，有 10 名處置改變。
• 研究期間，表型特定的定序套組（Table 25.4）、WES，甚至 WGS 愈來愈普及，改變了「標準檢測」的定義，也促成試驗提前終止。

NSIGHT2 隨機試驗（NCT03211039）

• 設計動機：上述因素，加上經驗證的致病基因與變異清單持續增加，使 NICU 定序的潛在臨床影響變大，研究團隊因而展開第二項研究。
• 設計：單一三級中心的隨機試驗，比較 rWGS 與快速全外顯子體定序（rapid WES, rWES）；對象為入住小兒或新生兒加護病房、病因不明的嬰兒。同時比較只分析先證者（proband）檢體與分析家族三人組。
• 未隨機者：被判定為「病況極重」（gravely ill）的嬰兒不隨機分派，直接接受超快速全基因體定序（ultra-rapid WGS, urWGS）。
• 診斷定義：在已知會造成相似表現的基因中，找到致病或可能致病變異。
• 收案條件：小於 4 個月，且距入院或距出現提示遺傳疾病的特徵小於 96 小時。
• 排除條件：
  • 感染或敗血症且對治療反應正常。
  • 僅有早產。
  • 單純非結合型高膽紅素血症。
  • 有明確誘發事件的缺氧缺血性腦病變。
  • 已確認的基因診斷足以解釋病情。
  • 單純暫時性新生兒呼吸急促。
  • 無法存活且已調整急救意願（modified code status）的新生兒。
• 判讀流程（與 NSIGHT1 不同）：先只分析先證者，單人分析未得診斷時再以三人組重新分析。
• 技術進步：WGS 與 WES 方法已能偵測 CNV 與 indels。
• 人力：分析、判讀與報告平均需要 6 小時專家工作量。
• 結果回報：若 rWGS 或 rWES 得到暫定診斷，且有特定治療可預防疾病或死亡，立即通知臨床團隊。
• 次要發現：與成人發病疾病風險相關的變異等次要發現不回報；但若家屬同意接收，則回報可處置的偶然發現。這是考慮在臨床使用 WGS 或 WES 時始終存在的議題。

NSIGHT2 結果

• 研究目標是把 WGS 與 WES 當第一線檢測，對象為出生後前 4 個月、估計族群檢測前機率相對較低的嬰兒。研究期間入住 ICU 的嬰兒將近一半符合資格。
• 最終收案 213 名（37%）：94 名隨機接受 rWGS，95 名隨機接受 rWES，另有 24 名重症嬰兒接受 urWGS。
• 整體 24% 得到基因診斷。

• 沒有嬰兒得到偽陽性結果。
• 1 名 rWGS 嬰兒若被分到 rWES 組，診斷就會被遺漏。
• 超過一半的變異是序列變異，其餘為 CNV、結構變異或小型插入／缺失；超過一半為新生變異。
• 在先證者之外加做三人組分析，147 名嬰兒中只有 1 名的診斷率因此提升。
• 不過 urWGS 組仍做三人組基因分型，以省去確認定序的時間；rWES 與 rWGS 組則另外對先證者與雙親做確認定序。
• 參與的臨床醫師認為，對 ICU 內病因不明嬰兒，第一線快速基因體定序臨床效用高、傷害可能性低；不論結果陽性或陰性，快速定序並回覆都被認為有益。

NICU-Seq 試驗（NCT03290469）

除了單中心的 NSIGHT 研究，還有兩項聚焦 NICU 的多中心 NGS 研究：NICU-Seq 與 GEMINI。

• 全名：NICUSeq: A Trial to Evaluate the Clinical Utility of Human Whole Genome Sequencing [WGS] Compared to Standard of Care [SOC] in Acute Care Neonates and Infants；2020 年完成收案。
• 設計：5 個中心。先證者隨機分到 15 天臨床 WGS（clinical WGS, cWGS）組或 SOC 組；SOC 由各中心臨床團隊決定。採時間延遲設計，確保所有受試者都能接受 WGS：
  • 實驗組：接受標準照護，第 15 天收到 cWGS 結果。
  • SOC 組：接受 SOC，第 60 天收到 cWGS 結果。
• 收案條件：120 天以下，依客觀臨床表現懷疑遺傳疾病；須至少一位生物學父母參與。
• 排除條件：已確立基因診斷、高度臨床懷疑非整倍體，或表型可完全以早產併發症解釋。
• 收案：19 個月內收 354 名（早期組 176 名、延遲組 178 名）；平均收案年齡 15 天；超過 80% 收案時在 NICU。

• 觀察期間的常規檢測因中心差異很大，從核型到 WGS 都有；檢測結果多為陰性的微陣列。
• 整體而言，有基因診斷的嬰兒約三分之二發生 COM，約占全世代四分之一。
• 個案一：早期組 1 名嬰兒經 WGS 診斷為 Wiskott-Aldrich 症候群（OMIM 301000），接受矯正性骨髓移植。
• 個案二：延遲組 1 名生後 11 天收案的癲癇嬰兒，最後經 WGS 發現未預料到的 KCNQ2（OMIM 602235）變異；停止進行中的代謝檢查，也停用無效的 pyridoxine。
• WGS 找到的致病變異類型廣泛：末端與間質染色體拷貝數變異、複雜複合異型合子變異、粒線體變異，以及造成 SMA 的 SMN1 拷貝缺失。
• 研究團隊的結論：WGS 帶來更聚焦、因而更好的照護，應考慮作為評估疑似遺傳疾病重症嬰兒的主要工具。

GEMINI 研究（NCT03890679）

• 全名與目的：Genomic Medicine for Ill Neonates and Infants，比較快速全基因體定序與標靶基因體定序套組（NewbornDx，定序 1722 個可處置基因，針對嬰兒期發病的疾病）的臨床與經濟效用。
• 對象：6 家醫院 400 名疑似遺傳疾病的高風險新生兒與嬰兒；年齡最多 1 歲，有遺傳疾病的徵候與症狀。
• 排除條件：已有已知基因診斷；重大先天異常合併產前檢測發現的染色體異常；先天性感染；因極度早產而無法存活。
• 檢測流程：
  • 嬰兒同時接受 NewbornDx 與 rWGS（先證者）。
  • 生物學父母（若可取得）同時接受 NewbornDx 檢測。
  • rWGS 先做嬰兒；若僅分析先證者未得到與表型相符的特定診斷，父母再接受 rWGS。
  • 兩種檢測都設計在 14 天或更短時間內完成定序與分析。
• 緊急個案：符合下列任一項者視為緊急，接受超快速定序與分析，於檢體送達後 72 小時內出具初步報告：
  1. 需要機械通氣。
  2. 有嚴重神經學併發症。
  3. 血行動力學不穩定。
  4. 應該中心主持人要求而歸入。
• 分析：先以電腦分析將個別嬰兒與已知正常比對；再由專家委員會將數百個變異對照已知疾病基因資料庫，判斷其致病可能。評估項目包括遺傳模式、變異頻率、變異後果及公開資料庫的報告。變異分為致病（P）、可能致病（LP）或 VUS。

GEMINI 期中報告（前 113 名）

• 51 名（45%）回報診斷性變異和／或 VUS。
• 83 名（73%）的 WGS 與高風險套組結果一致。
• 29 名嬰兒在得到結果後，照護有重大改變。
• 學到的教訓：標靶定序難以辨識非整倍體與其他結構變異；WGS 找到 8 個基因的變異，而這些基因不在標靶套組內。
• 3 位父母及其他家人因嬰兒的診斷而新確診遺傳疾病。

偶然發現 Incidental Findings

• 支持 NGS 的證據增加，費用與報告時間也下降，但費用不會是唯一考量。成本的長期變化見 Fig. 25.3，該圖出自美國國家人類基因體研究所（NHGRI）。
• 定序帶來的偶然發現有其倫理問題，NICU 應用時必須處理。WES 與 WGS 可能揭露到很晚才會出現的各種風險。
• 新生兒檢測中偶然發現的指引仍在演進，爭論持續；NSIGHT2 針對偶然發現另行取得同意，就是一例。
• 美國醫學遺傳學會已著手處理，提供每年更新的指引，列出廣泛定序時建議回報的基因（目前 73 個）。

早產相關常見複雜疾病的基因體學 Genomics of Common Complex Diseases Associated With Prematurity

NGS 檢測持續讓臨床醫師與家屬了解造成 NICU 病人複雜、嚴重表型的基因與變異；但要找出與早產較常見複雜疾病，如早產兒視網膜病變（ROP）、腦室內出血（IVH）、壞死性腸炎（NEC）、支氣管肺發育不良（BPD）相關的基因與變異，仍是難題。

為何要研究：基因型導向照護 Why Genetic Variation Matters

• 早產併發症與死亡及長期神經發展障礙密切相關。
• 找出這些疾病相關的基因變異，有助於依個別病人基因型發展預防與治療方法。
• 一些通常成人發病的疾病已有依基因型決定的給藥與治療策略，包括癌症（依腫瘤基因型指引治療決策）。
• 針對這些併發症做照護試驗時，把基因變異視為特定照護策略效果的潛在干擾因子可能很重要；成人 CYP2C19 基因型與 clopidogrel、aspirin 併用的交互作用即為一例。

遺傳率：先確認有遺傳基礎 Heritability

• 在費力檢測變異與疾病的關聯之前，必須先評估目標族群的遺傳率，也就是遺傳因素可解釋表型變異的程度。
• 新生兒領域主要靠比較同卵與異卵雙胞胎的疾病盛行率（Bhandari 與 Gruen 曾有說明）。
• 雙胞胎研究已發現 ROP、NEC、敗血症、IVH 與 BPD 都有顯著遺傳率。

候選基因／SNP 研究及其困境 Candidate Gene and SNP Studies

• 確立這些常見複雜新生兒疾病有遺傳基礎後，研究者開始檢測 SNP 與疾病的關聯。帶有次要（較不常見）等位基因（minor allele），有時會增強或減弱基因產物的功能。
• 早期研究聚焦於免疫反應或發炎相關蛋白，如 TNF alpha、IL-6 基因的 SNP，與 BPD、晚發型敗血症等疾病的關聯，但同一 SNP 的結果常常不一致。
• 早期報告多在相對小的世代中檢測少數 SNP，有些找到 p <0.05 的關聯。
• 然而基因體有 30 億個核苷酸、超過 30 million 個已知 SNP，個體基因體也帶有數千個變異，樣本數又相對小，因此結果難以重現。
• 於是候選基因分析（更精確地說是候選 SNP 分析）受到質疑，除非世代納入數千名病例與對照。

全基因體關聯研究 Genome-Wide Association Studies

• 早期證據鼓勵更不預設立場的作法，於是發展出更廣的基因與變異陣列，檢測全基因體多個候選基因的常見變異，但範圍不及全外顯子體或全基因體定序。
• 某 SNP 的等位基因基因型已知時，處於連鎖不平衡的 SNP 會有經常一起出現的特定基因型。隨著基因體知識擴增，已辨識出許多這類 SNP。
• 填補推算（imputation）與 tagSNPs：實際定型一個 SNP，就能預測鄰近 5–10 個 SNP 的基因型。
• GWAS 作法：定型數十萬甚至數百萬個 SNP 並推算 tagSNPs，再在表型定義良好的世代中逐一檢測關聯。
• 統計標準：因需做數百萬次關聯檢定，統計方法已相應調整；「全基因體顯著」（genome wide significance）的標準為 P < 5 × 10⁻⁸。
• 樣本數：要實際檢驗假說，最好有數千名帶疾病表型者。例如 Alzheimer 病的病例對照研究中，APOE 基因變異的關聯 P 值為 2.52 × 10⁻⁵³。納入 GWAS 的 NICU 病人只有數百名，很少達數千名，遠少於成人世代。
• 血統差異：極早產世代的另一項挑戰，是不同血統世代的次要等位基因頻率不同。冰島這類相對同質國家的樣本，可能得到較一致、可重現的結果；美國較常見的混合血統世代，則難以分析在不同血統間盛行率不同的變異與疾病的關聯。

早產兒視網膜病變 Retinopathy of Prematurity

• 已多次嘗試找出與 ROP 病理機轉合理相關的關聯，包括 VEGF 與 VEGF 受體，但候選基因／SNP 研究都未找到達全基因體顯著的變異。
• 一項報告測試涵蓋超過 100 個發炎與器官發育相關基因、超過 1000 個變異的套組，在嚴重 ROP 病人（相對於非嚴重或無 ROP）發現腦源性神經滋養因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）基因的 2 個內含子變異，P 值小於 5 × 10⁻⁷。
• 早產兒血清 BDNF 較低與 ROP 可能性較高相關。這為 ROP 與 BDNF 變異的關聯，或與含 BDNF、對神經血管發育重要之路徑上其他基因產物／成分的關聯，增添一些合理性。
• 這項結果雖有前景，但變異對 BDNF 濃度的影響尚未被描述。
• 較新的表觀遺傳分析發現，12 個不同基因的胎盤 CpG 甲基化與發生閾值前 ROP（prethreshold ROP）相關；這些基因也包括 BDNF。
• 至今沒有針對 ROP 的 GWAS。

壞死性腸炎 Necrotizing Enterocolitis

GWAS 發現：8q23.3

• 一項採 GWAS 方法的世代研究中，8 號染色體（8q23.3）跨越 43-kb 區域的一群 SNP，其次要等位基因使 NEC 風險上升：勝算比 4.72（95% CI：2.51–8.88），多個 SNP 的 P 值 <10⁻⁸。
• 如同許多極早產族群的基因關聯研究，本分析受限於小樣本（n = 751，僅 30 名手術性 NEC），收案來自美國多個中心，血統混合明顯。
• 值得注意的是，風險上升在此族群的 3 種基因血統中相近。
• 研究者未能在另一世代驗證這些 8 號染色體 SNP 與 NEC 的關聯。該世代是為找出嚴重 IVH 相關變異而做 GWAS 的早產兒（n = 1018，26 名手術性 NEC）。
• 電腦分析顯示，此區域在演化上似乎保守，但沒有已知基因。

路徑分析

• 檢測多個路徑相連基因的變異與 NEC 的關聯，發現與超過 50 條路徑相關，包括免疫反應、生長調控與 G 蛋白訊息傳遞。
• LTB4R 基因鄰近與手術性 NEC 強烈相關的 14 號染色體區域，編碼類花生酸受體（eicosanoid receptor）。路徑分析中，類花生酸受體訊息傳遞是受 NEC 相關 SNP 影響第二顯著的路徑。
• LTB4 在由類鐸受體 4（toll-like receptor 4）與環氧化酶-2（cyclooxygenase-2）介導的腸缺血／再灌流傷害機轉中扮演重要角色。

腦室內出血 Intraventricular Hemorrhage

• 數項候選基因研究在相對小的世代中，檢測發炎、補體與凝血路徑 SNP 的關聯。
• Gene Targets for Intraventricular Hemorrhage 研究團隊：候選基因研究
  • 7 個基因的 SNP；224 名第 III–IV 級 IVH 早產兒，配對 389 名對照。
  • 只有亞甲基四氫葉酸還原酶（Methylenetetrahydrofolate Reductase, MTHFR）基因的 SNP 與嚴重 IVH 有關，且結果模稜兩可。
• 同團隊：GWAS 分析
  • 測試超過 600,000 個 SNP；458 名嚴重 IVH 新生兒與 866 名無 IVH 嬰兒，來自美國與斯堪地那維亞世代。
  • 沒有任何單一 SNP 達全基因體顯著；先前的候選 SNP 也都沒有達到。
  • 一個 10-SNP 單倍型，範圍從 GM140 與 CACNA1E 之間的基因間區到 CACNA1E 內含子區，P 值為 7.16 × 10⁻¹⁰。
  • CACNA1E（鈣通道，電壓依賴型，R 型，alpha 1E 次單元）在孟德爾遺傳型偏癱性偏頭痛（已知的血管表型）及多種癲癇中有突變。
• 如同許多類似研究，這項 GWAS 的結論指出：常見變異只有小到中等的效應，因此必須建立大規模新生兒基因體醫學網絡，有能力維護可取用的資料庫，收錄序列變異、其表型關聯與環境風險因子。

支氣管肺發育不良 Bronchopulmonary Dysplasia

表型定義的難題

嚴重 ROP、NEC 與 IVH 的表型由影像或直接觀察定義；BPD 通常以某種程度的呼吸支持定義，使可能受基因變異影響的解剖與生理表型細節難以掌握。

GWAS

5 個團隊以不預設立場的 GWAS，尋找與流行病學定義之 BPD 相關的變異或基因、路徑內變異群，成果有限。

• 總結：5 項 GWAS 都未能找到與 BPD 明確且令人信服相關的特定基因或變異；但這些研究個別與整體都受限於小樣本與高度表型差異。

全外顯子體定序

研究者也把 WES 用於 BPD，希望在極端表型病人身上做更廣泛定序，以找出與疾病相關的罕見變異。

• Carrera 等（26 名嚴重 BPD）：
  • 依預測的蛋白質影響，以及是否為多位受試者共有基因中的新穎變異，把變異分為高、中、低影響。
  • 如預期，每位受試者約有 200,000 個變異；全部變異中約 10% 可能有中或高影響。
  • 每份檢體約有 100 個變異，經結構預測分析推測會影響蛋白質結構。
  • 2 名受試者有 ABCA3 新穎錯義突變；其產物負責把磷脂質運送到第 II 型肺泡細胞的板層體（lamellar bodies）。
  • 也發現 NOS2、類鐸受體基因及 C 反應蛋白的罕見與新穎變異。
• Li 等（新生兒篩檢檢體，50 對雙胞胎，含 51 名 BPD）：
  • BPD 受試者累積變異的 258 個基因，單倍不足評分（haploinsufficiency score）顯著較高。
  • 單倍不足：基因一個拷貝缺失或帶功能喪失變異，使基因產物劑量降低到足以影響功能。
  • 相較非 BPD 嬰兒，BPD 嬰兒的變異聚集於胚胎上皮發育、膠原組織與 Wnt 訊息傳遞路徑的基因，且有所增加。
  • 團隊也檢視 BPD 病人的人體組織，以及 BPD 高氧小鼠模型的肺組織；在暴露高氧的動物中，偵測到這些外顯子體候選基因表現增加。
• Hamvas 等（PROP，146 名：85 名 BPD、61 名未受影響）：
  • 資料來自 Prematurity and Respiratory Outcomes Program。
  • 345 個帶極罕見、非同義變異（nonsynonymous variants，會改變基因產物胺基酸序列）的基因，只出現在 BPD 受試者。
  • 這是至今最大的研究，重現了 28 個基因：它們在 BPD 病人帶極罕見變異，先前已在 Li 等報告的加州世代與 BPD 相關。

現有研究的限制與展望

• 目前的 GWAS 與 WES 研究受限於小樣本、表型定義困難，也難以找出非編碼區中可能對 BPD 或其他早產重要併發症致病機轉有影響的罕見變異。
• WES 已找到與帶罕見變異基因及候選路徑的關聯；WGS 方法尚未被測試。
• 如 NICU 的 NGS 研究所示，把這些廣泛定序方法用在更多嬰兒身上，可能找出個別嬰兒的致病遺傳因素。

結論 Conclusion

• 定序價格下降，定序、辨識與分析變異（比對日益擴大的基因—疾病資料庫）的速度加快，基因體學與遺傳學在臨床新生兒醫學的應用快速演進。
• 診斷的速度大幅加快，臨床照護必須迅速因應新知。作者稱之為「好的問題」（good problem）：如何最妥善地應用不斷增加的知識。

實例：該選哪一組呼吸疾病套組？ Choosing a Respiratory Gene Panel

NICU 醫師想了解為何某早產兒的呼吸疾病比預期嚴重，可考慮多種方法檢測與呼吸疾病相關的基因變異。一個選擇是開立基因套組，避開目前 WGS 或 WES 的費用。但要選哪一組？

• 以「respiratory disease neonate genetic panel」做 Google 搜尋，可找到 4 家公司的 4 項產品；再加上 Johns Hopkins DNA Diagnostic 實驗室知名的呼吸相關檢測，共 5 個選項。
• 各套組涵蓋基因數差距大（原文寫 5 到 125 個基因）。
• 全部都定序套組內基因的外顯子，以及靠近外顯子、可能具調控功能的區域。

• ABCA3、SFTPB、SFTPC：5 組全部都有。
• FOXF1、NKX2-1：4 組有。
• CSF2RA、CSF2RB：原文稱 2 組有（與 Table 25.4 的比對見章末）。

臨床反思：NICU 視角 Clinical Reflection—NICU Perspective

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